תאים הנמצאים באותה רקמה בגוף עשויים להיות שונים זה מזה -  ניתן לראות שפרופיל ביטוי הגנים שלהם שונה, למרות הצפי להומוגניות ברקמה. האם נובע הבדל זה משונות באזורי הבקרה על ביטוי גנים?

בכדי לאפיין שונות תאית באזורי בקרה אלה, פיתחנו שיטה המאפשרת השוואה בין אזורי בקרה זהים באוכלוסיית תאים. אזורי הבקרה בהם התמקדנו הינם אזורי הגברה (enhancers) האחראים, בעיקר, לעליה באפשרות של שעתוק גן מסוים. 

אזורי ההגברה מסומנים בדרך כלל על ידי שתי קבוצות כימיות (קבוצות מתיל או קבוצת אצטיל) המקושרות לחומצה האמינית ליזין, המופיעה בשני מיקומים שונים על זנב החלבון היסטון 3. (היסטונים הינם חלבונים המעורבים באריזת ה-DNA בגרעין). הכינוי המקוצר לאתרים אלה הינו H3K4me1 וH3K27Ac-, והם מסומנים בתמונה ככוכבים אדומים או ירוקים. 

רמת בקרה נוספת שקיימת על ה-DNA עצמו הינה מתילציה - הוספת קבוצת מתיל על גבי הנוקליאוטיד ציטוזין (C) באתרי CpG בגנום. באתרים אלה חוזר על עצמו רצף הנוקליאוטידים CG בתדירות גבוהה, והם נמצאו מקושרים לבקרה על ביטוי גנים. מודיפיקציה כימית זו נצפית גם על פרומוטורים (אזורים אליהם נקשר האנזים RNA polymerase המבצע את השעתוק) וגם על אזורי הגברה, והיא מסומנת בתמונה כעיגול שחור. 

השיטה המקובלת כיום למדידת רמות מתילציה על גבי ה-DNA הינה Bisulfite sequencing . בשיטה זו משתמשים בסודיום ביסולפיט על מנת לזהות האם הנוקלאוטיד ציטוזין קשור למתיל. כאשר מבצעים בדיקה זו על DNA המופק מכלל אוכלוסיית התאים ברקמה הנבדקת, משקפות התוצאות את ממוצע המתילציה בכלל אוכלוסיית התאים. מאחר ומדובר בממוצע, השיטה אינה רגישה מספיק לצורך זיהוי הבדלים במתילציה בין תאים שונים ברקמה הנבדקת, ולפיכך אינה מאפשרת לחקור שונות בין-תאית. 

בעבודה זו פיתחנו שיטת מדידה חדשה, המשלבת את שתי רמות הבקרה הללו – סמנים (מרקרים) בחלבון היסטון 3 (H3K4me1 וH3K27Ac-) ומתילציה על גבי ה-DNA. לשם כך איחדנו שתי שיטות מדידה גנומיות – ChIP  ו- bisulfite sequencing למדידה אחת (ראו תמונה). 

ראשית, בעזרת נוגדנים ספציפיים ל H3K4me1 או H3K27Ac שלפנו את אזורי ההגברה, ואז כימתנו את רמת המתילציה על גבי ה-DNA באזור המבודד. במידה שאוכלוסיית התאים הינה הומוגנית, ניתן לצפות לרמה אחידה של כמות המתילציה על גבי ה-DNA. 

להפתעתנו, גילינו כי אזורי ההגברה המסומנים ע"י H3K4me1 הראו רמות גבוהות יותר של מתילציה על גבי ה-DNA בהשוואה לאלה המסומנים ע"י H3K27Ac. מאחר ומדובר באותו אזור גנומי, ניתן להסביר את ההבדלים בדפוסי המתילציה של ה-DNA באזורי ההגברה השונים ע"י שונות בין-תאית. בעזרת single cell RNA-seq, שיטה המאפשרת מדידת רמות ביטוי של גנים ברמת התא הבודד, הראינו שלאזורי ההגברה הנ"ל יש תפקידים בבקרה על התמיינות תאי גזע עכבריים. לפיכך, היסקנו כי השונות במתילציה משפיעה על רמות ביטוי של גנים בתאים השונים ברקמה.

בזכות השימוש בשיטה שפיתחנו ניתן לגלות רובד נוסף ברמת הבקרה בתא, שיכול להסביר חלק מהשונות הבין-תאית.

קיראו את המאמר